Ученые из Массачусетского технологического института разработали новый инструмент генного редактирования, который может вырезать неисправные гены и безопасно заменять их новыми. С помощью этого метода исследователи заменяли гены длиной до 36 000 пар оснований ДНК в несколько типов клеток человека, а также в клетки печени мышей. Технология поможет при лечении заболеваний с большим количеством мутаций, например, муковисцидоза.
Предложенный метод объединяет предыдущие исследования в генной инженерии и биологии микроорганизмов. В частности, исследователи используют технологию нацеливания от CRISPR-Cas9, молекулы защитной системы бактерий и ферменты, с помощью которых вирусы заражают бактерии.
Технология CRISPR-Cas9 показала эффективность в процессе генного редактирования. Она состоит из фермента, разрезающего ДНК, называемого Cas9, и короткой цепи РНК, которая направляет фермент в определенную область генома, указывая Cas9, где сделать разрез. Недостаток этого метода заключается в том, что многочисленные разрывы двухцепочечной ДНК вызывают мутации, которые могут привести к побочным эффектам.
Ученые использовали интегразы — ферменты, которые бактеориофаги (вирусы) используют для встраивания своего генетического материала в клетки бактерий — чтобы создать метод, который не требует большого количества разрыва ДНК.
В своей работе исследователи использовали сериновые интегразы, которые могут вставлять огромные фрагменты ДНК, размером до 50 000 пар оснований. Эти ферменты нацелены на определенные последовательности генома, известные как сайты прикрепления, которые функционируют как «посадочные площадки». Когда они находят правильную посадочную площадку в геноме хозяина, они связываются с ней и интегрируют свою полезную нагрузку в ДНК.
Схематическое изображение метода PASTE. Изображение: Matthew T. N. Yarnall et al., Nature Biotechnology
Метод, который исследователи назвали PASTE, использует фермент Cas9, который делает единственный разрез в нужном месте и встраивает «посадочную площадку», состоящую всего из 46 пар оснований ДНК. Эта вставка может быть осуществлена без разрыва ДНК: сначала изменяется одна цепь молекулы с помощью слитой обратной транскриптазы, а затем вторая, комплементарная ей. После «подсадки» небольшого участка ученые запускают интегразу, которая связывается с ней и естественным образом встраивает длинный участок ДНК.
В серии экспериментов ученые показали, что они могут использовать PASTE для вставки генов в несколько типов клеток человека, включая клетки печени, Т-клетки и лимфобласты (незрелые лейкоциты). Они протестировали систему доставки с 13 различными генами полезной нагрузки, включая те, которые могут быть терапевтически полезными, и смогли вставить их в девять различных мест генома. При этом количество нежелательных вставок оказалось незначительным.
